公牛在负营养平面上管理112天，增加了睾丸活组织检查中雷帕霉素靶(mTOR)的丰度
(AS2040-13, 2021年9月)本研究的目的是确定不同营养平面对成熟肉牛睾丸组织中营养感知途径和雄激素受体丰度的影响. 营养代谢途径中关键调节因子的丰度, mTOR, 公牛在营养方面是否有所下降, 哪些因素会导致父辈生育能力的差异，或者精子传递给后代的信息.
本文是……的一部分 2021年北达科他州畜牧业研究报告.
实验程序
15头4到5岁的安格斯公牛来自斯特里特附近的中央草原研究推广中心, 本研究采用ND. 公牛被随机分配到两种处理中的一种:1)正营养平面设法增加12%的体重(POS), n = 8); or 2) a negative plane of nutrition managed to lose 12% BW (NEG, N = 7)，在繁殖季节之前的112天内. 公牛被安置在法戈的肉牛研究中心, 使用Insentec粗饲料摄取量控制系统(Markenese)单独饲喂, 荷兰)，饲料分配每两周调整一次，以实现目标生长轨迹. 第113天, 使用Heath等人改进的程序对所有公牛进行睾丸活组织检查., (2002). 短暂的, 公牛被关在一个液压消音槽里，阴囊区域用碘擦洗，并用酒精清洗. 活检目标部位(左侧睾丸外侧附睾头部下方约5cm处), 给予利多卡因3mL作为局部麻醉剂. 需要一个14毫米× 10厘米的自动活检(AccuCore Single Action Biospy), Inrad, Kentwood, MI)插入睾丸, 穿透阴道壁膜和内脏膜及白膜, 小心避开附睾. 左侧睾丸取实质活检核2个.
将组织样品置于10%福尔马林固定液中, 石蜡包埋, 用切片机切成5 μm厚的切片，放在玻片上. 如前所述，对载玻片进行免疫组织化学处理(Crouse等)., 2021). 简单地说，切片去蜡，再水化，并进行抗原回收. Slides were stained with monoclonal antibodies to either mTOR (ab32028; Abcam), p-mTOR (ab109268), 或AR (ab74272). 然后用IgCF633荧光抗体孵育，DAPI反染. 图像捕获在40×s放大与激光扫描头部附件倒置显微镜. 睾丸实质由两个不同的区域组成, 含有SC和发育中的精子的精管, 还有间隙空间, 或小管之间的空间(图2). 1).
对于每头公牛，随机选择三到五个精管进行图像采集. 用图像分析软件对图像进行进一步处理，测量精管和间隙内荧光染色的光密度, 哪个定义为染色的相对荧光强度除以所选视场的像素面积. 支持细胞的特征是细胞核内存在AR, 具有生殖细胞特征的在小管中保留细胞核的. 计数每个精小管的SC和生殖细胞的数量，并将生殖细胞的数量除以SC的数量得到一个比值.
数据采用SAS (Ver .)的GLM程序进行分析.9.4、SAS研究所. In.以公牛为试验单位，研究营养面(POS或NEG)的影响. 显著性设为P≤0.0.05，趋势为0.05 < P ≤ 0.10. 数据以平均值±标准误差(SE)表示。.
结果与讨论
在精管内总mTOR的光密度荧光染色测量中，两组间无差异(P = 0.89)或间隙(P = 0.86; 表1; 无花果. 2C – D).
| 项 | NEG-Mean | NEG-SE | POS -Mean | POS -SE | POS -P价值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 精小管 | |||||
| mTOR | 362.6 | 69.6 | 348.8 | 69.6 | 0.89 |
| p-mTOR | 1256.5 | 167.4 | 759.4 | 178.9 | 0.06 |
| 比率(p-mTOR / mTOR) | 4.0 | 0.9 | 2.8 | 0.9 | 0.32 |
| AR | 2588.2 | 626.4 | 3028.2 | 669.7 | 0.64 |
| 间质空间 | |||||
| mTOR | 107.5 | 14.8 | 111.2 | 14.7 | 0.86 |
| p-mTOR | 179.9 | 19.3 | 80.1 | 20.6 | 0.004 |
| 比率(p-mTOR / mTOR) | 1.8 | 0.2 | 0.8 | 0.2 | 0.009 |
| AR | 896.5 | 144.3 | 1003.0 | 154.3 | 0.62 |
Treatments were POS = bulls managed on a positive plane of nutrition over 112 d; NEG = bulls managed on a negative plane of nutrition over 112 d. AR = androgen receptor; mTOR = mammalian Target of Rapamycin; p-mTOR = 磷酸化mTOR; SE = standard error; ST = seminiferous tubule
P - mtor在间质间隙升高(P = 0.0037)，在精小管中有增加的趋势(P = 0.05).06) of NEG bulls compared with POS bulls (表1; 无花果. 2A – B). 两种治疗方法在精管内的AR发生率无差异(P = 0.64)和间隙(P = 0.62; 表1; 无花果. 2E – F). 支持细胞数量(P = 0.78)和生殖细胞(P = 0.生殖细胞与支持细胞的比值(P = 0.05).21)处理间无差异(表2)。.
| 项 | NEG-Mean | NEG-SE | POS -Mean | POS -SE | POS -P价值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 细胞计数 | |||||
| 支持细胞/ ST | 21.1 | 1.9 | 21.9 | 2.1 | 0.78 |
| 生殖细胞/ ST | 170.5 | 8.3 | 158.9 | 8.8 | 0.35 |
| 比率(生殖细胞/支持细胞) | 9.3 | 0.7 | 8.1 | 0.7 | 0.21 |
Treatments were POS = bulls managed on a positive plane of nutrition over 112d; NEG = bulls managed on a negative plane of nutrition over 112 d. SE = standard error; ST = seminiferous tubule
在营养水平升高的情况下, mTOR的丰度和活性增加有助于调节这些关键的代谢途径(Saxton) & 萨巴蒂,2017). 有趣的是, 尽管POS公牛血液中的关键mTOR信号(氨基酸和IGF-1)浓度增加, the abundance of p-mTOR within the seminiferous tubules and interstitial space was reduced when compared to NEG bulls (表1; 无花果. 1A – B). 虽然这种减少与预期的丰度升高相反, 先前的研究表明，喂食高脂肪饮食的大鼠的支持细胞中mTOR丰度降低(Cui等)., 2017). 在这个实验中, 由于血液中循环代谢物的改变和随后的体重增加，POS公牛可能也经历了类似的mTOR活性失调. 这可能会导致这些营养感知途径的失调，从而改变睾丸的代谢.
生殖细胞与支持细胞的比例较低可能表明支持细胞的代谢能力下降. 然而, 在这个实验中, POS和NEG公牛的生殖细胞数量和SC没有差异, 以及比例(表2). Guan等人. (2016)在绵羊模型中报告了类似的发现, 证明营养过剩或营养不足对成熟公羊的支持细胞数量没有影响. 而没有观察到治疗差异, 营养供应已被证明会影响精子质量并导致DNA损伤(Guan & 马丁,2017).
两种治疗方法在精管和间质间隙的AR丰度未见差异(表1)。. 然而, AR在细胞核中的定位已被证明是特定于某些生精阶段的, 表明在生殖细胞发育中的作用(Bremner等)., 1994). 对不同营养模型中小管阶段的进一步描述，可能有助于了解营养水平和激素信号的相互作用以及随后对精子发生的影响.
总之, 丰富的活化形式的营养感应调节器, 磷酸化mTOR, 在公牛睾丸组织中是否呈负营养水平增加. 这可能是改变了SC的营养可利用性的结果, 对循环代谢产物的过量或减少作出反应, 比如氨基酸. 未来的研究将评估葡萄糖和氨基酸转运体在精小管中的表达，以进一步阐明营养对SC功能和精子产生的贡献. 而在AR丰度和生殖细胞与SC的比值方面没有差异, SC内的代谢差异可能对精子质量产生持久的影响, 陛下生育, 以及传递给后代的表观遗传信息.
